背景簡介
宏基因組測序（Metagenomics Sequencing）是對環(huán)境樣品中的微生物群落的基因組進行高通量測序，主要研究微生物種群結(jié)構(gòu)、基因功能活性、微生物之間的相互協(xié)作關(guān)系以及微生物與環(huán)境之間的關(guān)系。宏基因組測序研究擺脫了微生物分離純培養(yǎng)的限制，擴展了微生物資源的利用空間，為環(huán)境微生物群落的研究提供了有效工具。
技術(shù)優(yōu)勢
直接對特定環(huán)境中全部微生物群體基因組進行測序。
環(huán)境微生物通常以群落方式共存和互作，宏基因組研究比單個個體研究更能反映微生物的真實生存狀態(tài)。
除分析微生物群體多樣性和豐度外，還可以解析微生物基因功能和參與的代謝通路，發(fā)掘新的具有特定功能的基因。
技術(shù)路線
分析內(nèi)容
樣本類型
環(huán)境樣品，總DNA等
建議總DNA起始量：5 μg，最低0.5 μg，濃度≥30 ng/μL（Qubit定量）
Q1：微生物群落研究方法比較？
A：16S rDNA測序：由于研究對象只為細菌的16S rDNA，因此16S測序技術(shù)更多只用于研究群落物種信息，也就是利用OTU物種分類、α和β多樣性分析等手段解答群落有什么物種，物種關(guān)系是什么等問題。因此，這種技術(shù)更多地只能了解到環(huán)境對微生物的組成有何影響，更偏向于單向關(guān)系研究。
宏基因組測序：宏基因組的研究對象為群落所有DNA，因此研究范圍更廣。理論上不單只可以了解群落的組成和多樣性等物種信息，同時，利用基因的注釋信息，還可以挖掘群落的核心功能和通路信息，在基因組層面了解這個群落到底有什么物種，這些物種能夠發(fā)揮什么功能。只有了解群落功能，才能知道它們對環(huán)境有什么影響，這有利于進行微生物與環(huán)境的雙向研究。
Q2：宏基因組測序原理？
A：將基因組DNA隨機打斷成若干條500bp左右的小片段（類似于拼圖中的單個形狀不一的模塊），然后連接接頭，在片段兩端加通用引物進行PCR擴增測序。將reads進行組裝拼接（類似于將眾多模塊拼成一副完整圖片），得到基因序列，眾多基因構(gòu)成完整的基因集。同時將獲得的reads片段或組裝好的基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對，得到物種注釋結(jié)果。
Q3：土壤樣本準備注意事項？
A：取土壤表層樣品（0~20 cm ），除去石塊和植物殘根等雜物，放入無菌封口袋中，立即置于冰盒 （建議使用干冰，以利更好地保持微生物原貌）中運回實驗室 ，馬上進行 DNA抽提。DNA 可置于 -20 ℃保存，長期保存建議置于 -80℃存放。 如無法進行DNA抽提，請盡快將樣本置于液氮中冷凍4小時以上，再轉(zhuǎn)移至-80℃保存 。
如采集根際土壤，拔取植株后，需抖落植株根部的大塊松散土壤，用已消毒的軟毛刷下附著在植物根際的土壤，放入無菌封口袋中，立即置于冰盒中運回實驗室 ，馬上進行DNA抽提。
Q4：水體樣品準備注意事項？
A：使用采水器采集水樣（建議1~2 L），置于冰盒（建議使用干冰，以利更好地保持微生物原貌）中運回實驗室，立即用無菌的0.22 μm醋酸纖維濾膜抽濾水樣（若水體渾濁，可使用無菌的大孔膜預濾后再使用 0.22 μm 濾膜；如 1張 0.22 μm濾膜無法收集全部菌體，可使用多張濾膜 ）， 取出濾膜后馬上進行樣品DNA抽提。 DNA可置于-20 ℃保存，長期保存建議置于-80℃存放 。如無法進行DNA抽提，請盡快將樣本置于液氮中冷凍 4小時以上，再轉(zhuǎn)移至-80℃保存 。
Q5：糞便樣本準備注意事項？
A：采集新鮮糞便樣品并迅速置于無菌離心管中 ，置于冰盒（建議使用干冰，以利更好地（建議使用干冰，以利更好地保持微生物原貌）中運回實驗室，馬上進行DNA抽提。DNA可置于-20 ℃保存，長期保存建議置于-80℃存放。如無法進行DNA抽提，請盡快將樣本置于液氮中冷凍4小時以上，再轉(zhuǎn)移至-80℃保存 。
宏基因組測序研究廢水處理過程中淤泥微生物抗性基因及移動元件
本文利用16S、宏基因組等技術(shù)研究在升溫厭氧消化處理污水的0d-57d天內(nèi)，淤泥中抗性基因、移動元件以及抗性基因宿主微生物的變化。在0d時，共發(fā)現(xiàn)13類抗性基因（Antibiotic Resistance Genes, ARG），其中9種含量都超過1ppm，ARG 總量從125.97ppm（0d）降低至50.65ppm（57d），其中氯霉素抗性基因、多耐藥性抗性基因等抗性基因降低多達50%以上。高溫處理后，移動元件總量由528.73ppm降低至391.36ppm。
本文研究表明，在消化處理淤泥過程中，隨溫度升高，會明顯降低淤泥中的抗性基因、移動基因組元件以及抗性基因宿主微生物的含量，其中抗性基因的降低可能是與移動元件以及宿主微生物的降低有關(guān)，因此高溫厭氧消化處理城市廢水污泥能夠有效的抑制抗性基因擴散到環(huán)境中。
參考文獻
Tian Z, Zhang Y, Yu B, et al. Changes of resistome, mobilome and potential hosts of antibiotic resistance genes during the transformation of anaerobic digestion from mesophilic to thermophilic.[J]. Water Research, 2016, 98:261.
樣品聚類分析通過對樣品進行聚類分析，構(gòu)建聚類樹，可以研究不同樣品之間的相似性。Bray-Curtis 距離是系統(tǒng)聚類法中使用最普遍的一個距離指標，它主要用來刻畫樣品間的相近程度，它的大小是進行樣品分類的主要依據(jù)。根據(jù)各物種在各樣品中的豐度表出發(fā)，以Bray-Curtis距離矩陣進行樣品間聚類分 析，并將聚類結(jié)果與各樣品的物種相對豐度整合進行展示。
KEGG注釋根據(jù)KEGG注釋總表，可以對KEGG注釋的總體情況進行Unigene數(shù)目的統(tǒng)計.
eggNOG分類統(tǒng)計圖eggNOG可以分為四個層次。第一層包括：1.信息存儲和加工；2.細胞過程和信號轉(zhuǎn)導； 3.新陳代謝；4.未確定分類。第二層進一步細分成25個分類，每一個分類都可以用一個字母表示。第三層為共同功能描述（Consensus Functional Description）。第四層為具體的直系同源蛋白簇。將Unigenes與eggNOG庫的蛋白序列進行比對（blastp，evalue≤1e-5），取分值最高的eggNOG比對結(jié)果序列（Hits）的注釋作為該Unigene序列的注釋。結(jié)合eggNOG數(shù)據(jù)庫的層次結(jié)構(gòu)，可以統(tǒng)計出eggNOG各個層級或水平的信息。
CAZy柱狀圖CAZy是一個特殊的數(shù)據(jù)庫，致力于分析碳水化合物活性酶的基因組，結(jié)構(gòu)和生 信息等。CAZy 數(shù)據(jù)庫主要涵蓋 6 大功能類：糖苷水解酶，糖基轉(zhuǎn)移酶，多糖裂合酶，碳水化合物酯酶，輔助氧化還 原酶和碳水化合物結(jié)合模塊。6個功能大類又可以進一步分成各功能小類，整個數(shù)據(jù)庫具有明顯的兩個層次的結(jié)構(gòu)。在過去的幾年里，CAZy分類家族不 斷擴展，為基因組和宏基因組的分析提供更完備的數(shù)據(jù)。
